Ames试验-细菌回复突变试验

2017-07-19

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Ames试验

遗传毒性试验是用于检测受试物通过不同机制直接或间接诱导遗传损伤的体外和体内试验。这类试验能够检出DNA损伤及其修复固定情况，包括通过表型改变检测基因突变和小片段缺失的试验，以及采用细胞学方法观察染色体结构或数目异常的试验。遗传毒性评价的目的在于评估药物对生殖细胞和体细胞的致突变性，对其遗传危害性进行初步判断，并预测其潜在的致癌风险。

ICH推荐的标准遗传毒性试验组合

组合一

细菌回复突变试验；
体外染色体畸变试验、体外微核试验或体外小鼠淋巴瘤tk基因突变试验（三者任选其一）；
体内微核试验或体内骨髓细胞染色体畸变试验。
此外，也可在动物给药后取外周血淋巴细胞进行细胞遗传学分析，但该方法较少采用。

组合二

细菌回复突变试验；
采用两种不同组织进行体内遗传毒性评估，通常包括体内微核试验及另一项体内试验。第二项体内试验一般用于评估动物肝脏中的DNA链断裂情况。
细菌回复突变试验是与致癌性检测较为相关的重要体外试验。

什么是细菌回复突变(Ames)试验

细菌回复突变试验（bacterial reverse mutation assay）是一种利用营养缺陷型突变菌株作为指示生物，用于检测基因突变的体外实验。常用菌株包括组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）和色氨酸营养缺陷型大肠埃希菌（E. coli WP2）。鼠伤寒沙门菌回复突变试验最早由美国加州大学的 Ames 教授在 20 世纪 70 年代建立并逐步完善，因此又称为 Ames 试验。

该试验用于检测化合物是否具有致突变性。其原理是通过观察受试物是否能使特定突变株恢复生长能力（即由组氨酸/色氨酸依赖型突变为原养型），以判断受试物是否具有引起基因突变的潜在作用。
试验应在有无S9代谢活化系统的条件下同时进行，以评价受试物在代谢前后可能产生的致突变效应。
※在培养细菌的琼脂培养基中加入少量组氨酸或色氨酸，使细菌能够在短时间内生长形成背景菌苔。当培养基中的组氨酸/色氨酸被耗尽后，只有发生回复突变的细菌才能继续生长，形成肉眼可见的菌落。

不同类型的Ames试验

实验类型	培养器皿	实验时间	受试物用量
标准Ames	100mm细胞培养皿	两周	400mg
Mini-Ames	六孔细胞培养板	1周	（1）80mg测试五个菌株（2）30mg测试两个菌株
Micro-Ames	24孔细胞培养板	1周	15mg
Ames II	384孔板	1周	< 5mg

GLP试验用标准Ames试验。
在符合GLP规范的遗传毒性研究中，通常采用标准Ames试验进行致突变性检测。

在药物筛选早期，常用的快速筛查方法包括Mini-Ames试验、Micro-Ames试验和Ames II试验等。这些方法的共同特点是所需样品量较少，适合早期开发阶段使用。

Mini-Ames或Micro-Ames试验通常选择两个菌株（即TA98和TA100，可检测98%致突变剂），为了消除另外2%的可能性，也可选用与标准Ames试验相同的五个菌株进行测试。

Ames II试验采用菌株TA98以及混合菌株TA7001至TA7006。该试验将细菌与受试物共同预培养，并经一系列稀释后，在30℃条件下培养过夜。随后，将菌液接种到含有选择性试剂5-FU和pH指示剂溴甲酚紫的384孔板中，通过紫外分光光度计检测培养基颜色变化（变黄程度），以评估受试物的致突变潜能。

Ames试验流程

受试物		浇到平板，孵育48-72小时
菌液
S9混合物/PBS

测试菌株（Ames试验系统）

在Ames试验系统中，应选择至少5种测试菌株，通常包括：

TA1535
TA1537、TA97或TA97a
TA98
TA100
WP2 uvrA、WP2 uvrA(pKM101)或TA102

各菌株在编码组氨酸或色氨酸生物合成相关基因的操纵子区域中含有不同类型的突变，用于检测不同机制的致突变作用。
国外多数实验室常选用WP2菌株，而国内实验室则更常采用TA102菌株。

测试菌株基因型和突变类型

菌株	氨基酸标记物			其它相关突变		质粒
菌株	突变基因	突变类型	主要基因靶点	膜突变	DNA修复	质粒
TA1535	hisG46	碱基置换	GC	rfa	UVrB	-
TA1537	hisC3076	移码	GC	rfa	UVrB	-
TA97	hisD6630	移码	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA97a	hisD6631	移码	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA98	hisD3052	移码	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA100	hisG46	碱基置换	GC	rfa	UVrB	pKM101
WP2 uvrA	trpE	碱基置换	AT	-	UVrA	-
WP2 uvrA (pKM101)	trpE	碱基置换	AT	-	UVrA	pKM101
TA102	hisG428	碱基置换	AT	rfa	+	pKM101 pAQ1